Estudios estructurales y funcionales de receptores colinérgicos

Cecilia Bouzat.

1990.

97 h. : ilustraciones ; 30 cm.

"Tesis Doctor en Bioquímica".

Director de tesis: Francisco J. Barrantes.

Tesis (doctoral)--Universidad Nacional del Sur. Departamento de Biología, 1990.

Resumen: La acetilcolina es un neurotransmisor que, actuando a nivel del sistema nervioso central y periférico, ejerce su acción sobre dos clases de proteínas receptoras: el receptor colinérgico muscarínico (AChRm) y el receptor colinérgico nicotínico (AChRn). Si bien los dos receptores son glicoproteínas de membrana sobre las cuales actúa el mismo ligando endógeno, sus estructuras y modos de acción son radicalmente diferentes. El AChRm es uno de los miembros de la superfamilia de proteínas acopladas a las proteínas transductoras G y ejerce su acción por medio de diferentes efectores bioquímicos. El AChRn es por si mismo un canal catiónico que permite el paso de iones cuando es activado por el ligando específico, produciendo la depolarización de la membrana que desencadena la respuesta celular. Estudios fundamentales en proteínas receptoras involucran la dilucidación de relaciones estructura-función, es decir, la identificación y caracterización de dominios y grupos claves necesarios para que las proteínas ejerzan sus funciones, tales como reconocimiento del ligando o apertura del canal. En este trabajo de tesis se ha utilizado una estrategia química para identificar en el AChRm la zona de la proteína asociada al sitio de unión de ligandos, y en el AChRn la influencia de determinados aminoácidos y grupos prostéticos en las propiedades y actividad del canal del AChRn. Se utilizó el antagonista mostaza de propilbencililcolina (PrBCM) para marcar irreversiblemente el AChRm en membranas sinaptosomales y neuronas. Como punto de partida se determinó la especificidad de la marcación y el número de sitios en los sistemas utilizados. La solubilización del receptor con SDS se llevó a cabo como un primer paso hacia la caracterización del AChRm. La utilización de distintas técnicas permitió demostrar que este receptor posee un peso molecular aparente de 68 kDa, un pI de 4.5 y oligosacáridos conjugados complejos de tipo biantenario o híbrido. La tripsinólisis limitada del AChRm marcado y solubilizado genera péptidos discretos conteniendo el ligando. El análisis, por medio de electroforesis en geles de poliacrilamida de alto grado de entrecruzamiento, demostró que dichos péptidos poseen PM de 50, 30, 18 y 8 kDa. La caracterización posterior de estos fragmentos marcados se realizó combinando técnicas de cromatografía de afinidad con electroforesis en geles de poliacrilamida. Se encontró que los fragmentos marcados de 50 kDa, 30 kDa y 18 kDa contienen el oligosacárido y grupos tioles mientras que el fragmento marcado de 8 kDa posee azúcares pero carece de grupos tioles. En base a estos datos se tomó al fragmento de 18 kDa como representativo de la distancia existente entre los azúcares y el sitio de unión covalente del ligando. Asimismo, el péptido de 8kDa es indicativo de la cercanía en que se hallan ciertos grupos tioles del sitio de unión covalente. //

Incluye referencias bibliográficas.