Entorno lipídico del receptor de acetilcolina nicotínico

Ida Clara Bonini.

1999.

213 h. : ilustraciones (algunas col.) ; 30 cm.

"Tesis Doctor en Bioquímica".

Director de tesis: Fransisco José Barrantes.

Título de la cubierta.

Tesis (doctoral)--Universidad Nacional del Sur. Departamento Biología, Bioquímica y Farmacia, 2000.

Resumen: A partir del descubrimiento de la existencia de un ánulo lipídico que rodea a AChR (Marsh y Barrantes, 1978) nuestro laboratorio se abocó al estudio de las interacciones entre esta proteína integral de membrana y los lípidos de su microentorno. Existen evidencias experimentales que sostienen la idea que el entorno lipídico, en el que se encuentra inmerso el AChR, tiene influencia sobre la función de esta proteína (Barrantes, 1993a,b). Ciertos lípidos, como el colesterol y los ácidos grasos alteran algunas de sus propiedades pero aún no se han dilucidado en detalle los mecanismos por los cuales modulan la actividad del AChR. Con el propósito de contribuir al esclarecimiento de esta temática, en este trabajo de tesis se determinaron las relaciones topológicas entre el AChR y algunos fosfolípidos de la bicapa lipídica y se discriminó entre aquéllos que ocupan preferentemente una u otra monocapa de las membranas ricas en AChR y/o los que se encuentran en el ánulo lipídico. Se caracterizó la composición lipídica de las membranas ricas en AChR obtenidas a partir de los órganos eléctricos de T. marmorata y de D. tschudii, torpediniforme capturado en aguas argentinas. En ambas especies, los glicerofosfolípidos de colina, de etanolamina y de serina son los constituyentes fosfolipídicos mayoritarios, seguidos por esfingomielina y fosfatidilinositol. Se observan semejanzas en el contenido y en el perfil de distribución de los lípidos en estas membranas, como así también en la relación molar entre fosfolípidos totales y colesterol total. Los procedimientos de extracción, aislamiento y cuantificación de lípidos se llevaron a cabo mediante el uso de técnicas que involucran fundamentalmente cromatografías en capa fina y en fase gaseosa. La aplicación del tratamiento alcalino a membranas ricas en AChR de T. marmorata y de D. tschudii resultó en la extracción de proteínas no receptoras, periféricas y de ciertos glicerofosfolípidos (~ 13 por ciento). Los extractos de NaOH están particularmente enriquecidos en fosfolípidos acídicos minoritarios como fosfatidato y polifosfoinosítidos. Cuando los electrocitos o las membranas ricas en AChR se incubaron con ( ) los polifosfoinosítidos acumulan la mayoría de la marca (~ 45 por ciento en D. tschudii; 96 por ciento en T. marmorata) y exhiben la actividad específica más alta. Las condiciones que favorecen el tipo de fosforilación Ca²+/calmodulina-dependiente deprimen la fosforilación de los polifosfoinosítidos y de las proteínas, sin ejercer mayor efecto sobre el fosfatidato. Además, el 50 por ciento de estos lípidos fosforilados son extraídos por el NaOH junto con las proteínas periféricas. El tratamiento alcalino también modifica el perfil de fosforilación de las proteínas de la membrana. Los resultados indican que los polifosfoinosítidos constituyen un pool lipídico metabólicamente muy activo en la membrana postsináptica y que se liberan preferencialmente de la membrana junto con otros fosfolípidos acídicos cuando se extraen las proteínas periféricas. En consecuencia, las membranas sometidas a este tratamiento no pueden considerarse equivalentes a las nativas en términos de composición fosfolipídica y perfil de fosforilación. Con el propósito de conocer las posibles interacciones entre lípidos nativos y proteínas y su topología en las membranas ricas en AChR, se estudió la localización de algunos fosfolípidos en ambas hemicapas mediante dos técnicas complementarias: derivatización química con ácido trinitrobencenosulfónico (TNBS), reactivo impermeable a la membrana, e hidrólisis enzimática con fosfolipasa C de B. cereus o con esfinogomielinasa en el caso particular de esfinogomielina. Las membranas ricas en AChR se incubaron con TNBS a 0-4°C y 37°C y la accesibilidad a sus aminofosfolípidos se comparó con la de los discos de fotorreceptores de segmentos externos de retinas bovinas y con la de membranas de eritrocitos de sangre humana. Los resultados indican que los glicerofosfolípidos de etanolamina se ubican principalmente en la cara externa de la bicapa mientras que la fosfatidilserina se localiza en la cara interna. Casi la mitad del contenido de los fosfolípidos de las membranas ricas en AChR se hidroliza por la fosfolipasa C con una vida media de ~ 1.6 minutos a 25°C. En coincidencia con los resultados derivados de TNBS, se degrada una mayor cantidad de glicerofosfolípidos de etanolamina que de fosfatidilserina. Después de 3 minutos de reacción, la velocidad disminuye y sólo se hidrolizan pequeñas cantidades adicionales de lípidos. En el caso particular de la esfingomielina, la hidrólisis controlada de las membranas nativas por esfingomielinasa muestra que este esfingolípido está localizado predominantemente (~ 60 por ciento) en la cara externa de la bicapa lipídica. También se observan diferencias en la distribución de sus especies moleculares en cada monocapa de la membrana. En la cara externa, el 61 por ciento de los ácidos grasos contiene más de 20 átomos de carbono mientras que la cara interna es rica en ácidos grasos de cadena más corta. Estos resultados evidencian que alrededor de la mitad de los fosfolípidos totales se ubican en cada cara de la bicapa lipídica de las membranas ricas en AChR y que la cara externa está enriquecida en glicerofosfolípidos de etanolamina, de colina y en esfingomielina mientras que los glicerofosfolípidos de inositol y de serina se ubican preferentemente en la cara interna de la bicapa. CALIFICACION DEPARTAMENTO DE GRADUADOS Calificación de la defensa oral: Sobresaliente - 10(diez) Fecha: 20/3/00

Incluye referencias bibliográficas (p. 160-204).