Aislamiento y estudio de secuencias promotoras de fagos de staphylococcus aureus

Silvia A. Piñeiro.

1992.

Paginación varia : ilus. ; 28 cm.

Tesis--Universidad Nacional del Sur, 1992.

Resumen: Se construyó un vector denominado /\prom33 para clonar e identificar fragmentos con actividad promotora, que reúne las siguientes características: * Dos orígenes de replicación, uno activo en Gram + y otro activo para Gram -; * Dos marcadores de selección, uno para Gram + (Cm) y otro para Gram -(Tet); * Un gen con fenotipo fácilmente detectable (síntesis de beta-lactamasa) sin su promotor original (Amp); * Un polylinker (sitio de clonado múltiple) en el lugar del promotor original del gen de resistencia a ampicilina; La funcionalidad del vector /\prom33 se verificó por inserción del promotor TAC en el polylinker. Con el vector /\prom33 se clonaron fragmentos con actividad promotora derivados de la digestión con enzimas de resricción de S. aureus. Se obtuvieron 4 clones que portaban fragmentos que mostraron una eficiencia promotora relativa superior al TAC. (clones 212, 2x, 43 y 285). Ninguno de los 4 clones tenían secuencias homólogas entre sí; 3 de ellos provenían del fago 85. El clon 212 presentó la mayor actividad promotora, le siguieron en orden decreciente los clones 2x, el 43 y el 285. Los fragmentos clonados en los plásmidos que muestran mayor eficiencia promotora correspondientes a los clones 212 y 2x se encontraron en zonas distintas del fago 85, aunque cercanas entre sí, ya que ambos estaban ubicados en un fragmento Ssp I del fago de 1780 pb. El análisis de la secuencia clonada en el clon 212 evidenció lo siguiente: El fragmento con actividad promotora contenía una secuencia rica en AT. Los estudios de homología con las secuencias consenso determinaron que las secuencias -35 y -10 más probables eran: TTGCAA, TTGTTA, TACAAT y TATATC. El análisis comparativo con secuencias promotoras de Gram + evidenció la existencia de un gran número de secuencias homólogas, para un 100 por ciento de homología, a las secuencias analizadas. La presencia de secuencias compatibles con estructuras de tipo "stem and loop" y de tipo palindrómicas. La presencia de grupos de As localizados upstream de las probables secuencias -35 y -10. La presencia de fuertes homologías con otros genes promotores descriptos para Gram + y bacteriófagos, de todos modos serían necesarios una serie de estudios ulteriores, tales como experimentos de "footprint" y mutaciones dirigidas para determinar exactamente la posición de las secuencias -35 y -10 (además del análisis por homologías) y permitir el análisis más preciso de las secuencias en cuanto a su homología con otros promotores descriptos.//

Incluye referencias bibliográficas.