Caracterización de un canal de K+ de la célula vegetal mediante la técnica de Patch-Clamp y sus posibles analogías con canales de K+ de células animales

Laura Patricia Zanello.

1993.

139 h. : ilus. ; 28 cm.

Tesis--Universidad Nacional del Sur, 1994.

Resumen: Caracterización de un canal de K+ de la célula vegetal mediante la técnica de Patch-Clamp y susposibl analogías con canales de K+ de células animales. Esta tesis trata el estudio, mediante la técnica de patch-clamb (Neher & Sakmann 1976; Sakmann & Neher 1984) de la actividad eléctrica de un canal de K+ presente en células vegetales. En una primera etapa se intentó llevar a cabo este estudio en células de vegetales superiores, adoptándose luego la membrana que rodea a la gota citoplasmática obtenida de la célula internodal de alga Chara contraria , bajo distintas condiciones iónicas , de voltaje y temperatura. Esta tesis pretende contribuir al conocimiento de los canales iónicos de las células vegatales, los cuales no han sido estudiados hasta el presente tan intensamente como los canales de las células animales. Las propiedades descriptas para este canal de K+ de una célula vegetal son asimismo comparadas con aquellas encontradas en la literatura para otros canales de K+ de células animales. Primeramente, se ensayaron diversos métodos para la obtención de células vegetales apropiadas para el estudio de corrientes iónicas por patch-clamb. Se desrrolló una nueva técnica para la obtención de protoplastos de células de tejido epidérmico foliar de Vicia faba (Zanello et al. 1988), caracterizada por : 1) el requerimiento de pequeñas cantidades de tejido vegetal inicial; 2) su rapidez, y 3) la marcada viabilidad de los protoplastos purificados. El procedimiento total rindió alrededor de un 6 por ciento de protoplastos de células epidérmicas (PCEs) y un 10 por ciento de protoplastos de células guardianas (PCGs), calculados sobre la cantidad total de estas células presentes en el tejido epidérmico utilizado. Las suspensiones finales de protoplastos obtenidos fueron un 100 por ciento puras para cada tipo celular. El estudio de la ultraestructura de los protoplastos mediante microscopía electrónica de transmisión confirmó la integridad de la membrana plasmática y de las organelas. La aplicación de la técnica de patch-clamb a dichos tipos de protoplastos rindió menos de un 10 por ciento de registros exitosos. Tal dificultad de obtener registros de actividad de canales iónicos sobre la membrana de protoplastos de células de vegetales superiores aislados por métodos enzimáticos ha sido reportada también por otros autores (Moran et al. 1984; Schroeder 1987). Para el estudio de las corrientes iónicas asociadas a la membrana de la célula vegetal se eligieron, como sistema experimental modelo para esta tesis, las gotas citoplasmáticas de célula internodal de alga Chara contraria, obtenidas de acuerdo al método desarrollado por Kamiya & Kuroda (1957). En este sistema se estudiaron diversos aspectos de la actividad eléctrica de un canal de K+ presente en la membrana que rodea estas gotas. La descripción funcional elemental de este canal de K+ se llevó a cabo en términos de su conductancia, dependencia del voltaje, y medición de las duraciones medias de los estados abiertos y cerrados (Zanello & Barrantes 1992). Se midieron conductancias unitarias de alrededor de 100 pS en soluciones simétricas de ClK 132 mM. La selectividad del canal al K+ frente a otro catión mono-valente como el Na+ resultó muy elevada (P Na / P K = 0,01). El análisis de la duración de los eventos de // Calificación de la defensa oral: Sobresaliente - Fecha: 16/6/1994

Incluye referencias bibliográficas.