Sistemas mensajeros y regulación del crecimiento y metabolismo de calcio por 1,25-dihidroxi-vitamina D3 en células musculares

María Julia Marinissen.

1996.

164 h. : ilustraciones ; 30 cm.

Tesis Doctoral en Biología.

Director de tesis: Ricardo Leopoldo Boland.

Tesis (doctoral)--Universidad Nacional del Sur. Departamento de Biología, Bioquímica y Farmacia, 1997.

Resumen: En este trabajo de tesis se estudiaron vías de transducción de señales involucradas en los mecanismos de acción no-genómico (rápido, a nivel de membrana) y genómico de la hormona esteroide 1,25(OH)2-vitamina D3, en células musculares de embrión de pollo cultivadas en monocapa. En células musculares cardíacas (miocitos) se observó que el 1,25(OH)2D3, a concentraciones fisiológicas, incrementa rápidamente el influjo de Ca²+ (1-5 min). La hormona ejerce parte de su acción no-genómica a través de la activación de la vía de la proteína quinasa C (PKC), mediante estimulación de la hidrólisis de fosfolípidos y liberación bifásica de diacilglicerol. Los datos obtenidos sugieren que la activación de PKC produce una regulación negativa de la actividad de la proteína quinasa dependiente de AMPc (PKA), modulando su acción sobre canales de Ca²+. Así, el 1,25(OH)2D3 regula el influjo rápido de este ión, crítico en la fisiología muscular, a través de un mecanismo de "cross-talk" que conecta las vías de transducción de señales de PKC y PKA. Se caracterizaron cultivos en monocapa de células de músculo esquelético (mioblastos) y se utilizaron como sistema experimental para estudiar la acción genómica, a largo plazo del 1,25(OH)2D3. Se observó que tanto el 1,25(OH)2D3, como los análogos sintéticos 1,24(OH)2-22ene,24ciclopropil-D3 y 20-epi-1,25(OH)2D3 de menor actividad calcémica que la hormona, modulan la síntesis de DNA, aumentando la incorporación de [3H]-timidina durante la etapa proliferativa del cultivo y disminuyéndola durante la fase de diferenciación de los mioblastos en miotubos. Los análogos fueron más potentes que el metabolito natural en la regulación de la división celular en ambas etapas del cultivo, observación que es de interés farmacológico para el tratamiento de miopatías dependientes de vitamina D. Se obtuvieron evidencias sugiriendo que el 1,25(OH)2D3 ejerce parte de su acción sobre la síntesis de DNA en mioblastos en estadío proliferativo, a través de la regulación de la vía de la PKC. Se demostró la presencia de las isoformas Ó, ß y Ù, con propiedades inmunoquímicas similares a las de mamíferos, y se observó que tratamientos largos (72 horas) con la hormona y el diacilglicerol sintético 1,2-dioctanoil glicerol (DOG) no afectan los niveles de expresión de las isoenzimas, contrariamente al efecto del éster de forbol TPA que aumenta los niveles de las isoformas. En cambio, los tres compuestos afectan la localización subcelular de PKC Ó, ß y Ù. El 1,25(OH)2D3 y el DOG, actúan de manera similar produciendo la translocación de la isoforma ß al núcleo y Ù a membrana, sugiriendo que la hormona activaría PKC a través de la liberación de DAG. Los cambios en distribución subcelular de PKC ß y de PKC Ù sugieren que estas isoformas estarían involucradas en los efectos producidos por el 1,25(OH)2D3 a nivel nuclear (síntesis de DNA) y de membrana (regulación de canales de Ca²+), respectivamente. En una etapa previa a la identificación definitiva de las funciones que cumplen las isoenzimas de PKC en las respuestas generadas por el 1,25(OH)2D3 mediante el diseño y aplicación de oligonucleótidos antisentido específicos para inhibir las isoformas de pollo, se realizaron experimentos de clonado y secuenciación de fragmentos de DNA amplificados por PCR utilizando primers con ambigüedades. Se clonó y amplificó un fragmento correspondiente a la región C4 de la enzima con una homología respecto a mamíferos de 54 por ciento y 54,4 por ciento a nivel de ácidos nucleicos y proteínas. El mismo será utilizado en futuros estudios como sonda homóloga para detectar regiones más extensas de las isoformas de ave. La estrategia experimental se validó amplificando PKC Ù y zeta de cerebro bovino. Los datos de secuencia, no reportados previamente, revelaron valores de homología superiores al 86 por ciento en promedio con las isoenzimas correspondientes en los demás mamíferos. CALIFICACION DEPARTAMENTO DE GRADUADOS Calificación de la defensa oral: Sobresaliente 10 (diez) Fecha: 3/4/97

Incluye referencias bibliográficas al final de cada capítulo.