Regulación no genómica del transporte intestinal de calcio en mamíferos por estrógenos y hormonas calciotrópicas

Gabriela Picotto.

1999.

[13], 229 h. : ilustraciones ; 30 cm.

Director de tesis: Ricardo L. Boland.

"Tesis Doctoral en Bioquímica".

Tesis(doctoral)--Universidad Nacional del Sur. Departamento de Biología, Bioquímica y Farmacia, 2000.

Resumen: En este trabajo de Tesis Doctoral se caracterizaron las acciones no-genómicas del 17ß-estradiol, 1,25-dihidroxivitamina D3 [1,25(OH)2D3; calcitriol] y paratohormona (PTH) en enterocitos de duodeno de rata, con especial referencia a la regulación del metabolismo celular de Ca²+ y las vías de señalización transmembrana involucradas. Niveles fisiológicos de las hormonas estimulan rápidamente (1-10 min) el influjo de ' ' en las células duodenales en forma dependiente de la concentración y del tiempo de incubación. Los efectos del 1,25(OH)2D3, 1alfa(OH)D3 17alfa-estradiol, progesterona, dihidrotestosterona y análogos de PTH fueron inactivos. La técnica de captación del radiotrazador ' ' acoplada al uso de antagonistas (dihidropiridinas, verapamil) y agonistas (Bay K8644) de canales de calcio dependientes de voltaje (VDCC) permitió establecer que en la modulación del influjo de Ca²+ por las hormonas participan los VDCC. Las vías dependientes de la activación de la enzima adenilil ciclasa (AC) y fosfolipasa C (PI_PLC) fueron implicadas en el mecanismo de regulación de VDCC. Diversos inhibidores y activadores de ambas vías de transducción bloquearon y reprodujeron, respectivamente, la estimulación en captación de ' ' inducida por 1,25(OH)2D3, 17ß-estradiol y PTH. La actividad AC y los niveles intracelulares de AMPc se incrementaron rápidamente en respuesta a las hormonas, demostrándose que los incrementos en AMPc son anteriores a la apertura de VDCC dado que los bloqueadores de estos canales no suprimieron los cambios en los niveles intracelulares del mensajero. Solamente para el 1,25(OH)2D3 pero no con 17ß-estradiol y paratohormona se detectó un aumento en proteína quinasa A (PKA), sugiriendo que la forma hormonal de la vitamina D3 regula VDCC por fosforilación, como los agonistas y neurotransmisores clásicos; se especula que el estrógeno y PTH podrían actuar según el novel mecanismo de canales modulados directamente por nucleótidos cíclicos. Con relación a la participación de la cascada de la fosfolipasa C, se comprobó un incremento en la generación de diacilglicerol (DAG) e inositoltrisfosfato (IP3) según un perfil bifásico para ambos mensajeros en el caso del 1,25(OH)2D3, compatible con la activación de la hidrólisis de fosfoinosítidos (PI) por PI-PLC; en cambio con el 17ß-estradiol y PTH, la respuesta fue monofásica para IP3 y bifásica para DAG indicando que la fase tardía de producción de diacilglicerol, insensible a bloqueadores de PI-PLC, está asociada al clivaje de fosfolípidos distintos de PI. El aumento observado en IP3 sugirió que la movilización de Ca²+ de depósitos endógenos, además de la activación de VDCC, interviene también en la regulación hormonal de los niveles intracelulares del catión ([Ca²+]i). El análisis espectrofluorométrico de las variaciones [Ca²+]i en células duodenales precargadas con Fura 2 confirmó la operación de ambos mecanismos y reveló aspectos adicionales del modo de acción del 17ß-estradiol. Para cada hormona la respuesta se caracterizó por una elevación inicial aguda (< 30 seg.) seguida de una fase sostenida de incremento en los niveles de Ca²+. Los compuestos nitrendipina y neomicina/U73122 bloquearon en forma parcial el incremento de [Ca²+]i congruente, respectivamente, con una estimulación del influjo de Ca²+ por VDCC y la movilización endógena del catión. En un medio extracelular nominalmente libre de Ca²* (+ EGTA) en presencia o ausencia de inhibidores de PI-PLC, y de bloqueadores de VDCC, luego de la readición de Ca²+, se obtuvieron pruebas definitivas sobre la activación de este mecanismo dual en enterocitos por 1,25(OH)2D3, 17ß-estradiol y PTH. El estrógeno puede estimular una vía alternativa de entrada de calcio, a través de canales SOC ("store operated calcium channels"), evidenciado por los efectos inhibitorios de Ni²+ y ' ' del influjo de Ca²+ y un aumento en la permeabilidad al Mn²+ detectado mediante "quenching" de la fluorescencia del Fura 2. De acuerdo con estos resultados, experimentos de tratamiento combinado y secuencial con las hormonas en medio extracelular ± calcio indicaron que la acción de 1,25(OH)2D3 y PTH involucran vías comunes de transducción de la señal del Ca²+ mientras que la detección de efectos aditivos con 17ß-estradiol apoyó adicionalmente la participación de los canales SOC. Estudios preliminares aportaron evidencias sobre la existencia de receptores de membrana que podrían mediar los efectos no genómicos del estrógeno. Así, el 17ß-estradiol inmovilizado por ligado a BSA incrementó el [Ca²+]i y antagonistas del receptor intracelular o ER (tamoxifeno, ICI 182,780) no bloquearon los efectos del esteroide. El análisis de Western blot utilizando anticuerpos específicos contra diferentes dominios del ER demostró la presencia de proteínas inmunoreactivas, algunas de distinto peso molecular al ER, residentes en la membrana plasmática de las células duodenales, lo cual sugiere que moléculas estructuralmente relacionadas con el receptor clásico podrían iniciar la transducción de la señal rápida del 17ß-estradiol en la superficie celular. Desde el punto de vista de los conocimientos básicos, se considera que el trabajo experimental realizado contribuye a la comprensión del mecanismo de transducción de la señal no-genómica de las hormonas esteroideas, en particular del 1,25(OH)2D3 y 17ß-estradiol, así como de PTH, en células intestinales de mamífero. Los datos aportan pruebas sobre acciones directas del 17ß-estradiol y PTH en duodeno, blanco no clásico para la acción de estas hormonas. Además, y no de menor importancia, la demostración de influjo de calcio vía SOC activado por estrógeno, constituye la primera evidencia sobre la existencia de estos canales en duodeno de rata siendo también novedosa su modulación por un esteroide. En cuanto a su aplicación, la información derivada de estos estudios se relaciona con el proceso de absorción intestinal de calcio, el cual está directamente implicado en numerosos eventos fisiológicos y patológicos (lactancia, osteoporosis, embarazo, insuficiencia hormonal). CALIFICACION DEPARTAMENTO DE GRADUADOS Calificación de la defensa oral: Sobresaliente - 10(diez) Fecha: 21/12/99

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