Acción de sustancias lipídicas sobre la funcionalidad del receptor nicotínico de acetilcolina

Ingrid Garbus.

2002.

iv, 133 h. : ilustraciones ; 30 cm.

"Tesis Doctor en Bioquímica".

Director en tesis: Francisco José Barrantes.

Tesis (doctoral)--Universidad Nacional del Sur. Departamento de Biología, Bioquímica y Farmacia, 2003.

Resumen: El receptor nicotínico de acetilcolina ha sido el miembro prototipo (AChR) de la superfamilia de receptores canales activados por ligandos (LGICs). Cada subunidad está compuesta por cuatro segmentos transmembranales (M1-M4). Se ha demostrado que la proteína se asocia preferentemente con algunos esteroles (Marsh y Barrantes, 1978); Ellena y col., 1983); y estudios de marcación por fotoafinidad indican que existe una proximidad estrecha entre colesterol y la proteína AChR en membrana (Middlemas y Raftery, 1987). Hemos aplicado aquí un enfoque farmacológico para caracterizar e sitio de unión de esteroides en el AChR. Estudiamos el efecto de varios esteroides naturales y sintéticos sobre la actividad del canal unitario del AChR mediante la técnica electrofisiológica de patch-clamp. Algunas sustituciones en el anillo ciclopentanoperhidrofenatreno afectaron preferencialmente la cinética del AChR, acortando el tiempo de estado abierto del canal, variando el efecto entre distintos esteroides. La presencia de un grupo polar en C11 contribuyó a la potencia inhibitoria del esteroide. Entre los esteroides monohidroxilados, como la 11- y 17-OH progesterona, el más potente fue el primero, exhibiendo un nivel de inhibición similar al del compuesto de referencia, hidrocortisona (HC). En términos del coeficiente de partición octanol-agua, se encontró inesperadamente una relación lineal entre la hidrofilicidad de los esteroides y su potencia inhibitoria. Estudiamos el posible efecto de mutaciones en la región M4 de la subunidad alfa del AChR sobre la modulación de este último ejercida por HC. Sobre la base de estudios de marcación por fotoafinidad realizados por Blanton y col. (1999) en AChR de órgano eléctrico, se realizaron mutantes en la posición alfaM4 412, que en el AChR murino corresponde a un residuo de glicina. Gly412 fue mutada por tirosina, triptofano, cisteína, serina y asparagina, explorando así los efectos del volumen, la hidrofobicidad y la carga de las cadenas laterales sobre las interacciones AChR-esteroide. Obtuvimos registros de canal único a concentraciones bajas (1 µM) y altas (30 µM) ACh. Estos canales mutantes mostraron parámetros cinéticos indistinguibles de los del receptor de tipo salvaje. Cuando expusimos a los canales mutantes a HC (200 y 400 µM), la inhibición fue de igual magnitud a la descripta para el AChR salvaje. Este hecho nos permite conducir que el residuo alfaM4 412 no está involucrado en la interacción HC-AChR. Utilizamos una mutante de canal largo (epsilonp264tAChR) para evaluar el posible efecto de progesterona, potente modulador de receptores neuronales (Bertrand y col., 199; Valera y col., 1992), en AChRs muscular y de Torpedo. Dado que dicha modulación se ejercería a través de los segmentos de transmembrana M4, obtuvimos registros en AChRs salvaje y el mutante G412C, ambos conteniendo la mutación epsilonp264t. Con este único cambio, los residuos expuestos a lípidos del segmento M4 de la subunidad alfa de ratón se hacen indistinguibles de los de Torpedo. Nuestros resultados confirman la insensibilidad del AChR de ratón a progesterona y nos permiten afirmar que este esteroide no modula al AChR de Torpedo, constituyendo este hallazgo un ejemplo más de la modulación diferencial por esteroides de receptores de ACh de tipo muscular y neuronal. Investigamos luego la respuesta farmacológica al progestágeno esteroide sintético promegestona, que marca por fotoafinidad el residuo alfaM4 412 de Torpedo (Blanton y col., 1999). No observamos modificaciones en los registros de canal único de AChR tanto del canal de tipo salvaje como en el mutante G412C tras la exposición a promegestona, restando así la posible participación de alfaM4 412 en el sitio de acción de HC, sugiriendo además que la marcación de la cisteína podría deberse meramente a su reactividad química y a la cercanía con el sitio de interacción. Profundizando la búsqueda del sitio de acción de esteroides sobre el AChR, realizamos mutaciones a Ala de otros residuos relevantes en alfaM4. Ensayamos primero una mutante cuádruple ("QM") en la cual los residuos Leu411, Met415, Cys418 y Thr422, supuestamente expuestos a lípidos (Blanton y Cohen, 1992, 1994), fueron sustituidos por Ala. La inhibición producida por HC sobre la QM fue evidente. Disecamos la mutante cuádruple en cuatro mutantes individuales de Ala, y encontramos que el grado de inhibición por HC en tres de ellos (L411A, M415A y C418A) fue de la misma magnitud que la observada para el AChR salvaje, en tanto que el canal AChR con la mutación Thr422 se comportaba coo el QM. Concluimos que el residuo Thr422 tiene gran relevancia en los cambios de sensibilidad a HC observados en el AChR mutante, sugiriendo su participación en el sitio de interacción esteroide-AChR.//CALIFICACION DEPARTAMENTO DE GRADUADOS Calificación de la defensa oral: Sobresaliente - 10(diez) Fecha: 23/9/02

Incluye referencias bibliográficas (p. 111-130).