Fosfatidiletanolamina N-metiltransferasa de segmentos externos de células fotorreceptoras de retina de vertebrados : caracterización, regulación y función

Marta Elena Roque.

1995.

122 h. : ilustraciones ; 30 cm..

"Tesis Doctor en Bioquímica".

Director de tesis: Norma María Giusto.

Tesis (doctoral)--Universidad Nacional del Sur. Departamento de Biología y Bioquímica, 1996.

Resumen: En este trabajo de tesis se identificó y caracterizó la fosfatidiletanolamina N-metiltransferasa (PE N-MTasa) de los segmentos externos (ROS) de los bastones de la retina bovina, enzima que cataliza la síntesis de fosfatidilcolina (PC), fosfatidil-N-monometiletanolamina (PMME) y fosfatidil-N-N-dimetiletanolamina (PDME) por el mecanismo de metilación de la fosfatidiletanolamina (PE). La síntesis de fosfolípidos metilados se determinó por incubación de los ROS en presencia de S-adenosil-L-[metil-3H]-metionina ([3H]SAM), como molécula dadora de grupos metilos. La cuantificación de la radioactividad en los fosfolípidos metilados, separados por cromatografía en capa fina bidimensional mostró, que el 85-90 por ciento de la radioactividad total se recuperó como PMME, PDME y PC. El análisis de la incorporación de grupos CH3 en los fosfolípidos individuales metilados mostró que PMME es el principal fosfolípido metilado (63 por ciento), seguido de PC (23 por ciento) y de PDME (14 por ciento). La actividad de la PE N-MTasa tuvo una respueesta lineal hasta una concentración de 0,4 mg de proteínas y hasta los 60 minutos de incubación. La actividad de la enzima fue dependiente de iones Mg²+, observándose a una concentración de 10 mM de este ion, la mayor incorporación de grupos CH3 en los fosfolípidos endógenos totales. La síntesis secuencial de fosfolípidos a partir de la PE endógena de los ROS se demostró por marcación de los fosfolípidos endógenos con 200 µM de [3H]SAM y su posterior demarcación en presencia de SAM no radioactiva. A partir del tiempo 0 de demarcación, la radioactividad presente en PMME y PDME disminuyó en función del tiempo, con un incremento paralelo en la marcación de PC. Los niveles de disminución de los primeros productos metilados PMME y PDME, fueron del mismo orden que el aumento observado en el producto final PC. La actividad de la PE N-MTasa está localizada en los ROS y no proviene de la contaminación con fracciones subcelulares de la retina. La medición de la actividad de enzimas marcadoras de membrana mitocondrial (citocromo c oxidasa) y microsomal (citocromo c reductasa) en las fracciones del gradiente para la obtención de los ROS y en las fracciones subcelulares de la retina mostró: 1) la actividad de la citocromo c oxidasa es mínima [6,5 nmol min-1 x (mg prot)-1] en la banda I (ROS purificados) y mayoritaria en la banda II del gradiente [65 nmol min-1 x (mg prot)-1], revelando la falta de contaminación mitocondrial en los ROS purificados; 2) la actividad de la citocromo c reductasa en la banda I del gradiente representó el 5 por ciento de la actividad presente en la fracción microsomal de la retina [7,28 nmol x min-1 x (mg prot)-1], lo que evidenció una mínima contaminación microsomal en nuestras preparaciones de ROS. La distribución de la actividad de la PE N-MTasa en las fracciones obtendias por centrifugación de los ROS crudos en el gradiente discontínuo de sacarosa, mostró que la banda I (ROS purificados) presenta los mayores valores de actividad específica [3,35 pmol x h-1 x (mg prot)-1] respecto a los valores de actividad presentes en la banda II [1,30 pmol x h-1 x (mg prot)-1] y en el pellet del gradiente [3,07 pmol x h-1 x (mg prot)-1]. La actividad de la PE N-MTasa en la banda I (ROS purificados) representó el 65 por ciento de la actividad presente en la fracción microsomal. Estos resultados confirman que la PE N-MTasa es una enzima de los ROS y que no proviene de la contaminación con fracciones subcelulares de la retina. El sistema de metilación enzimática responde a un modelo complejo donde intervienen múltiples sustratos fosfolipídicos (PE, PMME, PDME) y no fosfolipídico (SAM). La determinación del pH óptimo de la PE N-MTasa de los ROS se llevó a cabo metilando los fosfolípidos endógenos y exógenos en presencia de baja (10 µM) y alta (200 µM) concentración de SAM. En presencia de fosfolipídicos endógenos y baja concentración de SAM, la actividad de la PE N-MTasa mostró dos picos de máxima actividad a pH 8,5 y pH 10. El mayor nivel de síntesis de fosfolípidos metilados totales se observó a pH 8,5 [5 pmol x h-1 x (mg prot)-1] siendo el primer producto de la reacción (PMME), el principal fosfolípido metilado. A pH 10 se observó menor nivel de síntesis (50 por ciento), sin cambios en el perfil de incorporación de grupos metilos en los fosfolípidos individuales.// CALIFICACION DEPARTAMENTO DE GRADUADOS Calificación de la defensa oral: Sobresaliente Fecha: 15/4/96

Incluye referencias bibliográficas (p. 108-122).