Fosfolipasas y aciltransferasas en segmentos externos de células fotorreceptoras de retina de vertebrados : caracterización y función

Paula Inés Castagnet.

1995.

132 h. : ilustraciones ; 30 cm.

"Tesis Doctor en Bioquímica".

Director de tesis: Norma María Giusto.

Tesis (doctoral)--Universidad Nacional del Sur. Departamento de Biología y Bioquímica, 1996.

Resumen: Las membranas fotorreceptoras de los batones de retina son únicas entre las membranas estudiadas hasta el presente en cuanto a que presentan la mayor concentración de ácidos grasos poliinsaturados esterificados a sus fosfolípidos. El mantenimiento de esta composición particular depende del metabolismo de las especies moleculares en los distintos fosfolípidos. El recambio de acilos de los fosfolípidos en los segmentos externos de los bastones (ROS) ha sido descripto, sin embargo, las enzimas involucradas en este proceso no han sido caracterizadas. En este trabajo de tesis se determinaron las características y la modulación de : a) la actividad enzimática que en los ROS hidroliza a los ácidos grasos de la posición sn-2 de los fosfolípidos, la fosfolipasa A2 (PLA2), utilizando para ello fosfolípidos marcados con ácidos grasos radioactivos y fosfolípidos de las membranas como sustrato; b) la actividad de la oleoil-CoA:lisofosfolípido aciltransferasa utilizando para ello oleoil-CoA y lisoPtdCho exógena, y la acilación de los lisofosfolípidos endógenos utilizando para ello distintos ésteres de CoA. a)Los estudios empleando 1-palmitoil-2 [1-14C]araquidonoil-sn-glicero-3-fosfocolina como sustrato y a las membranas de los ROS como fuente de enzima permitieron establecer las condiciones óptimas para la actividad de la PLA2. La liberación de ácido [1-14C]araquidónico fue lineal hasta los 10 minutos y hasta una concentración de 600µg de proteína en el ensayo. La enzima presentó la mayor actividad a pH9. La hidrólisis del ácido [1-14C]araquidónico a partir de fosfatidilcolina por la PLA2 depende de la concentración de Ca²+ en el medio de incubación. Cuando todo el Ca²+ presente en las membranas fotorreceptoras es acomplejado por el quelante específico EGTA la actividad de la PLA2 representa el 27 por ciento de la actividad máxima medida en concentraciones óptimas del ión. Al incrementar la concentración de Ca²+ en el medio de incubación, la actividad de la PLA2 en los ROS también aumenta hasta alcanzar un valor máximo a una concentración de calcio 0,2 mM. Concentraciones mayores del ión producen una inhibición de la actividad de PLA2 que alcanza a un 50 por ciento a la máxima concentración de calcio ensayada (5 mM). Los estudios de actividad de la PLA2 de los ROS en función de la conentración de sustrato mostraron que la enzima presenta un comportamiento de tipo Michaelis Menten con un Km=36,5µM y una Vmax=612 pmol x h-1 x (mg prot)-1. Siendo la luz el estímulo natural de las membranas fotorreceptoras altamente especializadas en la conversión de la señal lumínica en impulsos nerviosos, se investigó si la actividad de la PLA2 en estas membranas era modulada por las condiciones de iluminación. Los resultados obtenidos en membranas incubadas en luz muestran que la PLA2 es estimulada un 60 por ciento en los ROS crudos y un 30 por ciento en los ROS purificados, respecto a la actividad obtenida en membranas incubadas en oscuridad. Este estímulo fue reproducido en membranas incubadas en oscuridad en presencia del análogo no hidrolizable el GTP, el GTP—S, indicando que la transducina, proteína G mayoritaria en estas membranas involucrada en el proceso de la fototransducción, media el estímulo ejercido por la luz. La actividad de la PLA2 puede sufrir alteraciones si se modifica la estructura de la membrana sobre la cual actúa. Para determinar si la actividad de la PLA2 de los ROS depende de la estructura de la membrana, los ROS purificados se incubaron en presencia de Triton X-100 (detergente no iónico), deoxicolato de sodio (detergente aniónico) y CHAPS (detergente zwitteriónico) a concentraciones por debajo y por encima de su concentración micelar crítica. Los detergentes estudiados a todas las concentraciones ensayadas, salvo el Triton X-100 a la menor concentración utilizada (0,05 mM), produjeron una inhibición de la actividad de la PLA2. Esta inhibición fue más marcada en presencia de CHAPS y de deoxicolato de sodio, respectivamente. La inclusión de para-bromo fenacil bromuro, un inhibidor de PLA2 que interactuaría con una histidina del sitio activo de la enzima, en el medio de incubación produjo una inhibición del 25 por ciento sobre la actividad del la PLA2 de los ROS, sugiriendo que en estas membranas existe una población heterogénea de PLA2 con distinta sensibilidad al compuesto. Con el propósito de determinar si la actividad de la PLA2 se encuentra asociada a la membrana del ROS como una proteína intrínseca o periférica, si es una proteína soluble o si la actividad se halla presente en ambas fracciones, se realizó el ensayo enzimático en segmentos externos intactos y en las membranas y los respectivos solubles obtenidos luego de tratar a los ROS con buffer Tris-HCI a moderada (100 mM) y a baja (5 mM) fuerza iónica para extraer las proteínas solubles y las proteínas solubles y periféricas, respectivamente. Los resultados obtenidos muestran que el 75 por ciento de la actividad de la PLA2 se encuentra asociada a la membrana mientras que un 25 por ciento se localizó en el soluble.// CALIFICACION DEPARTAMENTO DE GRADUADOS Calificación de la defensa oral: Sobresaliente Fecha: 28/9/96

Incluye referencias bibliográficas (p. 105-130).