Cultivo de tejidos para la obtención de variantes somaclonales de pasto llorón, Eragrostis curvula (Schrad.) Nees.

Pablo A. Polci.

1999.

xiii, 151 h. : ilustraciones col. ; 30 cm.

"Tesis Doctoral en Biología".

Directora de tesis: Viviana Echenique; co-director: Luis Mroginski.

Tesis (doctoral)--Universidad Nacional del Sur. Departamento de Biología, 2000.

Resumen: El objetivo de esta tesis fue desarrollar un sistema de cultivo in vitro para diferentes cultivares de pasto llorón, Eragrostris curvula (Schrad.) Nees, que permita la obtención de plantas fértiles y determinar el modo de regeneración de esta gramínea. Asimismo, se investigó la posibilidad de ampliar la variabilidad en la especie, fundamentalmente para cultivares de reproducción apomíctica obligada, por medio del cultivo in vitro. La variabilidad fue analizada a varios niveles: citogenético, isoenzimático, molecular y morfológico. Se trató de identificar plantas con caracteres de importancia práctica como mayor calidad forrajera y/o mayor resistencia a estreses abióticos como frío y sequía. Dicho carácter sería fijado y transmitido sin segregación ni recombinación a la progenia debido a la reproducción apomíctica. Los resultados fueron los siguientes: -Se regeneraron plantas completas y fértiles de 4 cultivares (tres apomícticos obligados: Tanganyika 2n=4x=40, Morpa 2n=4x=40 y Don Pablo 2n=7x=70 y uno facultativo: Kromdraai 2n=6x=60), por tres diferentes vías de desarrollo: embriogénesis, organogénesis y regeneración directa. -A partir de pequeños segmentos de inflorescencias inmaduras en un medio básico de Murashige y Skoog suplementado con 2,4-D (1,2,4,6 u 8 mg.l a la menos 1) se obtuvieron callos embriogénicos y organogénicos. -Con todas las concentraciones de 2,4-D utilizadas se produjo inducción y proliferación de callo, aún en el medio que contenía 8 mg.l a la menos 1. Sin embargo, elevadas concentraciones de BAP, afectaron la inducción y proliferación de callo y la regeneración y el crecimiento de las plantas. Una concentración de 1mg.l a la menos 1 de este regulador de crecimiento o superior provocó una rápida oxidación de los explantos y/o callos. -Las concentraciones de 2,4-D más apropiadas para la inducción y el desarrollo de callos fueron 2 y 4 mg.l a la menos 1 combinadas con una concentración de BAP de 0,01 y 0,1 mg.l a la menos 1. -A partir de estos callos se obtuvieron plantas saludables y fértiles. - Se observaron diferencias genotípicas en la capacidad morfogénica. El apomíctico facultativo cv. Kromdraai respondió mejor a las condiciones de cultivo, generando mayor cantidad de masas callosas, más voluminosas y un elevado número de plantas (88 de 156 las plantas regeneradas). Un total de 32 y 23 plantas fueron obtenidas de los apomícticos obligados Morpa y Tanganyika respectivamente. Estos dos cultivares no mostraron diferencias entre sí, demostrando una respuesta intermedia en capacidad morfogénica en relación a los demás. El cultivar Don Pablo presentó una baja respuesta en cultivo, obteniéndose solo 13 plantas. -Bajo similares condiciones de cultivo (medio de cultivo, temperatura y fotoperíodo), pero con elevada intensidad lumínica (66 µmol m-² s a la menos 1) pudo observarse regeneración directa de plantas a partir de los primordios florales. Las plántulas fueron transplantadas a macetas, en invernáculo, donde completaron su desarrollo. Réplicas de las mismas se mantienen en condiciones de campo. Semillas de estas plantas fueron utilizadas para generar la población R 1. Se analizaron 156 plantas Ro y 697 R 1. El análisis de las plantas reveló que: -La variación generada por cultivo in vitro fue grande y pudo evidenciarse en todos los niveles investigados, citogenético, isoenzimático y molecular. - A nivel citogenético, el estudio del comportamiento meiótico permitió detectar mayor variación que el estudio mitótico. - En el nivel tetraploide (Morpa) a consecuencia del cultivo in vitro se produjeron aberraciones cromosómicas normalmente no presentes en el control, mientras que en el nivel hexaploide (cv. Kromadraai) incrementaron las aberraciones preexistentes. -El comportamiento de las plantas obtenidas in vitro fue muy similar al de plantas sometidas a estrés por déficit hídrico durante el período reproductivo. La variabilidad isoenzimática generada in vitro es importante para cultivares de reproducción apomíctica obligada. En el facultativo Kromdraai, la variabilidad generada in vitro no fue mayor que en la normal del cultivar. Estas diferencias observadas entre los cultivares apomícticos obligados y el facultativo Kromdraai apoyan la hipótesis de que la variación somaclonal es de utilidad en cultivos con sistemas genéticos limitados, como apomícticos o reproductores vegetativos en genral y/o con base genética estrecha, en contraste con los muchos ejemplos en cereales como cebada y maíz donde la variación somaclonal ha resultado de menor utilidad, sugiriendo que es menos exitosa en cultivos que han sido sujetos a mejoramiento intenso, siendo la sexualidad el método más importante para generar variación. - El cultivo in vitro causó alteración en el modo reproductivo, permitiendo la hibridación entre cultivares apomícticos obligados. Esta sería una fuente adicional de variación. El restablecimiento del modo reproductivo en la generación de R 1 permitiría mantener y multiplicar los genotipos híbridos que resultaran de interés. -La prueba de componentes principales resultó de utilidad para estudiar la variabilidad en caracteres morfológicos, posibilitando la identificación de los individuos en sólo dos dimensiones. Permitió detectar diferencias entre las plantas regeneradas y los controles agrupando a las mismas por caracteres tales como producción de semilla o forraje. -Los cambios observados en la generación Ro fueron transmisibles a la generación R 1. - En caracteres morfológicos los cultivares más variables fueron Kromdraai y Tanganyika. - A la mayor variabilidad del cv. Tanganyika habría contribuido la hibridación. - Los RAPD permitieron detectar la variabilidad no detectable por otros métodos, corroboraron los cambios obtenidos con isoenzimas en otras plantas y aportaron pruebas adicionales de hibridación. - La variabilidad morfológica para los cultivares Morpa y Don Pablo fue menor que la obtenida para caracteres citológicos, isoenzimáticos y moleculares. Algunos de los cambios genéticos son difíciles de observar a nivel morfológico o fisiológico debido a que una diferencia estructural en un producto génico podría no alterar su actividad biológica lo suficiente como para producir un fenotipo alterado. Por ello se insiste en la necesidad de evaluar la variación a diferentes niveles. Determinar las mutaciones silenciosas a niveles morfológico y fisiológico es importante ya que permite una estimación de la frecuencia de cambio genómico como resultado del cultivo in vitro. A fin de encontrar variabilidad en caracteres asociados con la resistencia a sequía se estudió la ultraestructura y composición química de la cera epicuticular foliar.// CALIFICACION DEPARTAMENTO DE GRADUADOS Calificación de la defensa oral: Sobresaliente - 10(diez) Fecha: 11/02/00

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